目前最為常用的重組蛋白表達(dá)質(zhì)粒載體融合了復(fù)制子(Replicon)、啟動(dòng)子(promoter)、篩選標(biāo)簽(selection marker)、多克隆位點(diǎn)(MCS)和融合蛋白移出策略(fusion tag removal strategy)。
因?yàn)镃CK8測定是基于活細(xì)胞中的脫氫酶活性,影響脫氫酶活性的條件或化學(xué)物質(zhì)可能導(dǎo)致實(shí)際活細(xì)胞數(shù)與使用CCK-8測定活細(xì)胞數(shù)之間有差異。
ELISA:基于酶催化底物產(chǎn)生顯色反應(yīng)來檢測。CLIA:利用化學(xué)發(fā)光物質(zhì)在化學(xué)反應(yīng)中產(chǎn)生的發(fā)光信號進(jìn)行檢測。
不同的抑制劑作用機(jī)制不同,有的抑制劑與底物競爭酶的活性中心,從而阻礙底物與酶的結(jié)合,稱為競爭性抑制;有的抑制劑與酶活性中心以外的基團(tuán)結(jié)合,使酶的構(gòu)象改變而不能與底物結(jié)合,稱為非競爭性抑制。
在使用分光光度計(jì)過程中,應(yīng)注意安全。避免接觸高壓電源和高溫部件,以免發(fā)生觸電和燙傷事故。同時(shí),應(yīng)遵守實(shí)驗(yàn)室的安全規(guī)定,正確使用化學(xué)試劑和樣品。
酶促化學(xué)反應(yīng)中的反應(yīng)物稱為底物,一個(gè)酶分子在一分鐘內(nèi)能引起數(shù)百萬個(gè)底物分子轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物,酶在反應(yīng)過程中并不消耗。但是酶實(shí)際上是參與反應(yīng)的,只是在一個(gè)反應(yīng)完成后,酶分子本身立即恢復(fù)原狀,又能進(jìn)行下一次反應(yīng)。許多實(shí)驗(yàn)證明,酶和底物在反應(yīng)過程中形成絡(luò)合物。
標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度的確定不僅需要科學(xué)的計(jì)算和嚴(yán)格的操作,還需要結(jié)合實(shí)驗(yàn)過程中的實(shí)際情況進(jìn)行動(dòng)態(tài)調(diào)整和優(yōu)化。
固定劑與甲醛不同,戊二醛的這一步反應(yīng)是不可逆的,而且需要氧氣的參與。由于大塊的樣品內(nèi)部氧氣供應(yīng)不足,戊二醛在大塊樣品的內(nèi)部無法形成穩(wěn)定的生成物,會(huì)導(dǎo)致樣品內(nèi)部的固定效果不佳。因而在使用戊二醛固定時(shí),小塊的樣品固定效果較為理想。戊二醛通過交聯(lián)作用固定蛋白質(zhì)的過程會(huì)伴隨氫離子的釋放,使樣品pH值降低。為了維持pH值穩(wěn)定在最佳水平,在戊二醛的固定劑中要加入足量的緩沖液。